Docking Proteína-Ligante - Básico

Utilizando o Chimera como uma interface para atracamento utilizando o Autodock Vina (1).

Observações: Adaptado e traduzido a partir do tutorial "VINA with UCSF Chimera" construído por José R. Valverde, disponível AQUI, apenas para fins didáticos nas disciplinas de bioinformática na graduação e pós-graduação do IMD/UFRN.

Primeira Parte: preparando o receptor.

• Abrir o programa UCSF Chimera. Clique em Fetch e em pdb, coloque o código 1GVN. A estrutura é imediatamente visualizada após o download.
• A etapa de preparação é crucial para o processo de atracamento. Primeiro faremos a preparação da proteína receptora. Para isso vá no menu e siga os passos abaixo:
  • Tools > Surface/Binding Analysis > Dock Prep.
• Vamos remover o solvente e ajeitar os resíduos não-padrões, utilizados para o processo de cristalização. Adicionalmente os átomos de hidrogênio e as cargas serão adicionadas. Para isso marque as opções:
  • Delete Solvent.
  • Change: Marque todas as caixas.
  • Add Hydrogens.
  • Add Charges.
  • Write Mol2 file.
• Uma caixa de diálogo abre logo depois para a adição de hidrogênios. Nesta caixa, deixe as opções padrões:
  • Method: also consider H—bonds.
  • Protonation states for: Residue-name-based para todos os resíduos.

Você pode especificar o estado de protonação para resíduos específicos se necessário.

• Após a adição dos H, uma outra caixa, chamada Assign charges for Dock Prep aparecerá. Nesta atribuiremos as cargas da proteína utilizando um campo de força AMBER. Este campo de força, no entanto, não contém carga para a maioria dos átomos não-proteicos. Para estes, temos 2 opções:
  • AM1-BCC - Baseado em mecânica quântica, semi-empírico. Preciso. Lento.
  • Gasteiger - Regras empíricas. Rápido.
• Agora vamos especificar as cargas líquidas. Após a adição dos H, uma caixa de diálogo aparece, contendo Specify Net Charges.
• Para moléculas não-proteicas no modelo (se incluídas):
  • Especifique a carga líquida esperada para todas as moléculas ou especifique como computar as as cargas para cada átomo nas moléculas.
  • Geralmente, para resíduos proteicos e moléculas não-proteicas, o chimera irá checar que a soma das cargas atômicas levará a um número inteiro que coincide com a carga esperada.
• Salve o receptor “preparado" como um arquivo .mol2: 1gvn.mol2.

Segunda Parte: preparando o Ligante.

O ligante que iremos trabalhar é a molécula de uridina-difosfato-N-acetilglucosamina (UNAG ou ND1). A estrutura deste ligante pode ser obtida nos seguintes bancos de dados:

• PDB
• ZINC
• PubChem

O arquivo do ligante pode ser obtido a partir do arquivo .mol2 do banco de dados do ZINC, ou pode ser construído no próprio UCSF Chimera, usando o SMILES (simplified-molecular input-entry system), seguindo os passos abaixo:

• Tools > Structure Editing > Build Structure.
• No diálogo, clicar em SMILES string. Colar o código e dar um nome a molécula (UNAG).
• Clicar em Apply.

O arquivo .mol2 pode também ser aberto diretamente no UCSF Chimera.

Terceira Parte: preparando e executando o Dock

• Ir no menu:
  • Tools > Surface/Binding Analysis > AutoDock Vina

Agora vamos selecionar as moléculas e atribuir o que é cada uma. Primeiro vamos dar um nome base para todos os arquivos gerados do dock. (Ex. 1gvn+unag).

• Especificar o receptor e o ligante:
  • Receptor: 1GVN.
  • Ligante: UNAG.

Depois de especificados receptor e ligante, iremos agora selecionar uma área para exploração. A fronteira será delimitada na forma de um paralelepípedo para a procura. Marcar e preencher da seguinte forma:

• Clique em Enclose the active site using the mouse e preencha os valores abaixo:
  • Center: —15 / 35 / 60
  • Size: 25 / 25 / 25

Observe agora as (clicando em expandir) as opções do Receptor e do Ligante. Expanda as opções avançadas (Advanced options):

• Selecione o número de modos de ligação para serem gerados: 9.
• Selecione a intensidade da busca: valores mais baixos irão ser processados mais rapidamente, mas serão menos exatos.
• Selecione o limiar de corte para ser reportado. Posicionamentos com escores fora desta faixa de kcal/mol em relação ao melhor serão descartados.

Agora expanda o menu Executable location. Você usar a opção Opal web service, onde o dock será executado remotamente. Você pode também baixar os executáveis do AutoDock Vina a partir do site do programa: http://vina.scripps.edu.

Use o que melhor convir. A instalação local do recomenda-se a instalação do Autodock Vina é sempre recomendada, principalmente se estiveres usando uma máquina com sistema baseado em UNIX.

Assegure-se de tudo está correto, com o seguinte cheklist:

• Receptor é 1GVN, Ligante é UNAG.
• A caixa verde engloba completamente o sítio ativo.
• As opções do receptor e do ligante estão corretas.
• A exatidão, limiar e posicionamento estão da maneira que você quer.
• O executável correto do Autodock Vina foi escolhido.

Depois de conferido, clique em OK e espere o processo terminar.

Quarta Parte: inspecionando os resultados

Após o término do processo, o Chimera irá abrir a interface View Dock. Nesta teremos um resultado tabular dos posicionamentos selecionados. A partir dela, você poderá:

• Modificar a ordem de classificação.
• Computar as propriedades e adicioná-las a tabela.
• Organizar os posicionamentos em:
  • Viáveis.
  • Apagados.
  • Excluídos.

Agora iremos verificar as ligações de H entre o ligante e o receptor, que é uma etapa importante de avaliação do processo de docking.

• Clique em: HBonds > Add counter to entire receptor.
• Apenas queremos as ligações de H entre o ligante e o receptor, portanto clique na opção Inter-model.
• Queremos distinguir as ligações de H inexatas: Color H­bonds not meeting precise criteria differently.
• Não queremos ligações intramoleculares ou intra-resíduos.
• Nós queremos ver todas: If endpoint atom hidden, show endpoint residue.

Agora inspecione as ligações de H. Elas contribuem de forma significativa para a estabilidade da ligação. Você pode classificar os confôrmeros de acordo com as ligações de H formadas.

Compare com uma estrutura de referência: 1gvn+unag.pdb (também inserida no SIGAA).