Modelagem Comparativa de Proteínas 2

Utilizando outros servidores e ferramentas para a modelagem de proteínas.

Objetivos

• Demonstrar outros servidores para obtenção de modelos 3D de proteínas, utilizando abordagens multifuncionais.

Proteína Alvo

Usaremos nestes exemplos a proteína O46921_SPIOL:

>O46921_SPIOL
LRSSPLVSHLFLRQRGGSAYVTKTRFSTKCYASDPAQLKNAREDIKELLQSKFCHPIMVR
LGWHDAGTYNKDIKEWPQRGGANGSLSFDVELRHGANAGLVNALKLLQPIKDKYSGVTYA
DLFQLASATAIEEAGGPTIPMKYGRVDATGPEQCPEEGRLPDAGPPSPAQHLRDVFYRMG
LDDKDIVALSGAHTLGRSRPERSGWGKPETKYTKDGPGAPGGQSWTAEWLKFDNSYFKDI
KEKRDADLLVLPTDAALFEDPSFKVYAEKYAADQEAFFKDYAEAHAKLSNQGAKFDPAEG
ITLNGTPAGAAPEKFVAAKYSSNKRSELSDSMKEKIRAEYEGFGGSPNKPLPTNYFLNIM
IVIGVLAVLSYLAGN

Escolhemos esta proteína para verificar se estas outras abordagens conseguem atribuir de forma não supervisionada alguma estrutura a porção C-terminal da tAPX.

AIDA

O Ab Initio Domain Assembly Server - AIDA é um servidor para obtenção de modelos que se baseia no conhecimento do potencial ab initio. Ele procurar os melhores arranjos para os domínios, mantendo a conectividade das cadeias. As estruturas são mantidas rígidas durante a simulação de minimização de energia, tratando apenas as regiões de link como completamente flexíveis. A grande vantagem do servidor AIDA é a capacidade de trabalhar com proteínas contendo domínios descontínuos, fixando suas posições relativas. Adicionalmente, ele também procura por domínios de sequência e ao achá-los divide-os iterativamente para alinhar com o modelo de PDB encontrado pelo programa de reconhecimento de folds FFAS-3D (Retirado do próprio site do AIDA).

A sua utilização é simples, e os seus resultados saem de forma rápida. Note que ele não é um programa de ab initio puro, embora utilize esta abordagem como parte de sua estratégia de modelagem.

Faremos a utilização do AIDA da forma mais simples, seguindos os passos abaixo:

• Abra a página do AIDA:

• Cole a sequência acima no espaço indicado.
• Insira o seu email e clique em Submit

Resultados

Após algus minutos, o AIDA retornará os resultados. A página de resultados está dividida da seguinte forma:

Primeira Parte: Arquitetura dos domínios encontrados

• Funciona como um preditor de estrutura secundária. Nela um diagrama da sequência é descrito, com a posição de cada resíduo, o tipo de estrutura secundária e escore de confidência da predição.

Na figura acima os resultados não estão mostrados por inteiro.

• Logo abaixo deste diagrama temos a lista dos domínios, com o PDB similar e o Z-score.
• Perceba que a predição encontrou um domínio para a região C-terminal da O46921_SPIOL (a qual está ligada a membrana do tilacóide), com similaridade a cadeia B da estrutura 3BO0.

Segunda Parte: O modelo construído

• Uma figura interativa da estrutura predita, com link para download do arquivo.

Terceira Parte: As estruturas isoladas de cada domínio

• Figuras interativas da estrutura predita da região de cada domínio.

• Verifique no Domínio 2, a predição da estrutura da hélice transmembrana presente na região C-terminal da O46921_SPIOL.
• O arquivo PDB gerado pode ser baixado AQUI.
• Abra o arquivo utilizando o UCSF Chimera e o inspecione.

Não esqueça de fazer o download e salvar os resultados do AIDA.

PHYRE2

O Phyre2 é um conjunto de ferramentas disponíveis na web para prever e analisar a estrutura das proteínas (Kelley et al. 2015). Ele usa múltiplas abordagens (homologia, threading e refinamentos de loops via ab initio) para obter modelos de forma fácil e não supervisionada. As grandes vantagens do servidor Phyre2 são:

• Fácil de usar e rápido.
• Resultados confiáveis, principalmente com proteínas que possuam homologia com proteínas conhecidas.
• Autoexplicativo.
• Bons resultados quando buscas por homologia distante são necessárias.

O Phyre possui dois modos: normal e intensivo. Os mantenedores recomendam utilizar primeiro o modo normal, para depois passar para o intensivo.

Passos para a submissão

• Abra a página do Phyre2.

• Cole a sequência fasta da O46921_SPIOL no local indicado.
• Coloque o email de destino dos resultados.
• Selecione o modo Normal.
• Clique em Phyre search e espere os resultados (demoram cerca de 30 minutos a 2 horas).

Resultados

Os resultados das análises com Phyre2 podem ser baixados ou ficam com um link disponível por 30 dias.

COs arquivos gerados para a modelagem da O46921_SPIOL podem ser diretamente baixados AQUI.

Os resultados do Phyre2 são mostrados na forma de um relatório, contendo os seguintes elementos:

Sumário dos resultados

• Nesta parte podem ser observados uma figura com o modelos, os links para download dos resultados, e outras informações sobre a modelagem. A parte que contem Confidence Summary é muito informativa, pois nela você saberá a confiança da modelagem ao longo da extensão da sequência.

• Logo abaixo, pode ser evidenciado a predição de estrutura secundária:

• E depois a predição de domínios e listagem dos templates:

• Sempre confira também a seção Multi-template and ab initio information. Nela você terá a informação de quantos resíduos tiveram de ser modelados por ab initio.

Questionamentos

Compare os resultados do Phyre2, com os outros resultados obtidos até agora. Houve discrepância? Qual?

I-TASSER

O I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) é uma abordagem hierárquica para a predição da estrutura de proteínas e previsão de suas respectivas funções. Ele também utiliza uma abordagem múltipla (comparativa utilizando homologia, threading e ab initio). Ele foi classificado como o melhor servidor para previsão de estrutura de proteínas em experimentos CASP e sempre utiliza algoritmos de última geração. A estratégia completa do programa pode ser vista AQUI.

Devido a qualidade dos seus resultados, podemos afirmar que ele é um dos melhores preditores automáticos de estrutura proteica, principalmente em níveis mais baixos de similaridade. Sua utilização é Free para usuários acadêmicos cadastrados (requer email institucional). Além do servidor, uma versão stand-alone (Linux apenas) pode ser baixada para rodar em suas próprias máquinas. No entanto, o tamanho do banco de dados é grande, além do custo computacional, o que pode ser impraticável para muitos computadores.

Para submeter uma predição no i-TASSER, siga os passos abaixo:

• Abra a página de registro do i-TASSER e preencha o formulário com um email institucional.

Você não precisará fazer isto durante este tutorial, pois os resultados já foram obtidos para a proteína O46921_SPIOL.

• Após receber a confirmação por email, vá até a página do I-TASSER.

• Cole a sequência no espaço indicado e preencha as informações de login.
• Clique em Run I-TASSER.

Os resultados demoram cerca de 48 h e enquanto eles estiverem na fila ou sendo executados você não poderá enviar outro trabalho.

Para fins de exemplo, durante a predição da estrutura da O46921_SPIOL, algumas modificações foram realizadas e testadas. A opção III, de especificar a estrutura secundária para alguns resíduos foi ativada. Nela colocamos a predição de estrutura secundária apenas para a alfa-hélice transmembrana predita pelo PSIPRED. O formato do arquivo de especificação é simples, e ele está denotado abaixo na íntegra:

355 Y H
356 F H
357 L H
358 N H
359 I H
360 M H
361 I H
362 V H
363 I H
364 G H
365 V H
366 L H
367 A H
368 V H
369 L H
370 S H
371 Y H
372 L H
373 A H

Se você quiser repetir a análise, basta salvar o texto acima em um arquivo de texto puro e submeter na opção III do servidor do I-TASSER.

Os resultados para esta predição podem ser evidenciados no link abaixo:

AQUI

Quark

O QUARK (que foi desenvolvido pelo mesmo grupo de pesquisa do i-TASSER) é um algoritmo de computador para previsão de estrutura de proteínas usando a abordagem ab initio e folding de peptídeos, visando construir um correto modelo 3D de proteína apenas a partir da sequência de aminoácidos. O uso do Quark é bem similar ao do i-TASSER, e uma conta criada a partir de um e-mail institucional é necessária.

Você pode fazer o pedido a partir de sua conta .edu.ufrn.br. Para a sequência abaixo você não irá precisar rodar o Quark, pois os arquivos de saída já estarão prontos. O pedido de conta para o i-TASSER e o QUARK são diferentes e separados.

Para o Quark, iremos apenas modelar por ab initio a região de âncora a membrana, predita tanto pelo PSIPRED como pelo TMHMM (no tutorial de obtenção de informações a partir da sequência). Vamos aos passos:

• Abra a página inicial do QUARK:

• Cole a sequência abaixo no campo para a sequência:

>O46921_SPIOL-TM
PTNYFLNIMIVIGVLAVLSYLAG

Note que existem alguns aminoácidos a mais do que a sequência colocada como hélice no i-TASSER.

• Coloque seus dados de Login e deixe o restante das opções como está.
• Depois de algumas horas, você receberá no e-mail cadastrado um link para a página com os resultados da predição. A página será similar a mostrada abaixo:

• Não esqueça de fazer o download dos arquivos, pois a página só fica no ar durante tempo limitado.
• Os resultados para esta modelagem poderão ser baixados AQUI.

Observe nos resultados que o Quark modelou a hélice e categorizou os aminoácidos de acordo com a sua acessibilidade ao solvente:

Os resíduos com valores 0 (zero) estão completamente "enterrados" (não acessíveis ao solvente), pois estão dentro da membrana. Tais dados podem lhe ajudar a colocar a membrana nesta posição, posteriormente.

Colocaremos agora o Quark para rodar com toda a sequência não alinhada da O46921_SPIOL (tAPX) a sua isoforma Q7GDV4_SPIOL (sAPX), de acordo com a figura abaixo:

Portanto, a sequência que será realizada a modelagem agora será a descrita abaixo:

>O46921_SPIOL-TM
RSELSDSMKEKIRAEYEGFGGSPNKPLPTNYFLNIMIVIGVLAVLSYLAGN

A página com os resultados será parecida com a seguinte:

Verifique os resultados (que também podem ser obtidos AQUI